2016/3/4 16:09:07
提问者:李健 |
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western blot电泳时电压电流设置有无公式
您好！我是分子生物学课程的学生，关于western blot电泳时电压设置我浏览了一些论坛，众说纷纭，转膜（湿式）的电流设置也是，请问有没有什么规则或者公式一类的呢？
| 王松梅 2016/3/4 21:59:06 |
李健，你好。 关于蛋白电泳的电压，以及转膜条件，确实有很多不同的说法。不同的实验室有不同的习惯，没有绝对的统一标准。你进你们实验室做这方面的实验的时候，你的师 兄师姐会教给你你们实验室自己的protocol。目的都是将蛋白很好地通过电泳分离开或者转移到膜上。个人认为，只要能出好的实验结果，很多实验细节不重要，当然，有些原则性的东西不能变动，那另当别论。这就是为什么我们上课的时候尽量想把每一步的道理交待给同学，知道了为什么就能知道怎么优化实验步骤 了。
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2016/3/4 15:46:07
提问者:葛潇潇 |
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计算DNA浓度
您好！我是分子生物学课程的学生，上一次实验课计算的DNA浓度，由于计算采用的机器是BioTek，没有传统的直径为1cm 比色杯；我按照D=0.5cm进行了演算， 结果与机器读值相差十倍，但是我记得实验步骤中并未进行样品稀释，为什么结果会不一致呢？
| 王松梅 2016/3/4 21:56:23 |
葛潇潇，你好。 谢谢你的认真。也许是我上课没说清楚，现在尝试回答如下： 1. 上次测的DNA浓度确实没有稀释，直接点了5 ul在测量板上的相应位置上，其实就是玻片上的一个点，盖上盖子后两块玻片之间的缝隙是0.5 mm，这也就是光线通过的路径（光径）。所以，光径是0.5 mm，不是cm。这样算出来的结果就不会相差十倍了。
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2013/3/29 17:02:55
提问者:李琳 |
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western blotting问题想请教一下
我是05级八年制的李琳，前几个月的时候您给我们上过分子生物学技术的实验课，我最近自己在做western blotting，有一些问题想请教一下，
1、蛋白是在加样后才结合SDS的？因为加样缓冲液里好像没有SDS2、浓缩胶制成后置于TBST后置于4度冰箱内一周内发现胶内有结晶形成，为啥？3、加样缓冲液为何没有SDS和DDT？（分子克隆里有）4、为何需要反复清除未聚合的Acr和Bis，有影响吗？5、分子克隆里还提到在加样后再加等体积加样缓冲液，为啥？
| 邵红霞老师 2013/3/29 17:07:00 |
1. 加样缓冲液也可以有SDS，可能我们教科书的配方上没有，不同实验室会有不同配方，有些实验室的配方中加有SDS。
2. 结晶的问题，请检查冰箱的温度，是否太低，存放的时候不要靠近冰箱内壁。
3. DTT与2-ME的作用相似，我们用2-ME
4.电泳在胶中的泳动受多种因素的影响，清除未聚合的Acr和Bis，保证蛋白在凝聚的胶中泳动以减少干扰
5. 加等体积的加样缓冲液是因为一般加样缓冲液配成2倍浓缩，这样就变成1倍工作浓度了，为减少你们上样的总体积，我们给你们用6倍浓缩的加样缓冲液，故与分子克隆上写的不一样。
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2013/3/29 17:01:20
提问者:林学生 |
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Cla I和EcoR I的酶切问题
这两天在写southern的实验报告，有个地方不太清楚，我看课本上写是Cla I和EcoR I的酶切片段做探针，但我们DNA酶切的时候是用Hind III和EcoR I的，是为什么呢？
| 邵红霞老师 2013/3/29 17:06:34 |
做探针和Southern Blot中酶切的意义是不一样的，做探针时是用Cla I和EcoR I从c-myc基因中切出所需要的4.8kb的片段，进行地高辛标记作为探针用。而在Southern Blot中，酶切的作用是将基因组DNA切成合适的小片段以便于与探针结合，靶片段的大小约8.5kb。
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