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教学答疑

      

    2013/3/29 17:00:33
    提问者:彭学生

    实验八Southern印迹杂交 P29 3.2"在2*SSC中漂洗的问题

    实验八Southern印迹杂交 P29 3.2"在2*SSC中漂洗",为什么要在2*SSC中漂洗> 呢?P30出现了多种洗膜液和缓冲液,老师上课时好像也没有具体讲每种的用途,因此这些过程的作用都不是很了解,能否详细解释一下? 

    王松梅老师 2013/3/29 17:05:58
    我们实验课的操作步骤中,把经2×SSC漂洗这一步去掉了。洗膜液和缓冲液很多,我记得上实验课的时候应该都把作用交代了的。洗膜液1和2的作用是为了把粘附在尼龙膜上的多余的探针洗掉,降低背景。1和2的区别是里面的盐浓度不同,及洗膜温度不同。洗膜液1的盐离子浓度较高,洗膜温度较低,这种洗膜状态,我们称为“低严谨度”洗膜,洗膜液2的盐离子浓度较低,洗膜温度较高,称为“高严谨度”洗膜,会洗的更干净。洗膜的一般程序就是从低严谨度到高严谨度的顺序。而洗膜液3是为了洗掉膜上未结合的多余的抗地高辛抗体,降低膜背景。这点你可以通过仔细看实验步骤得知。缓冲液也有3个。缓冲液2是封闭液,目的是为了封闭尼龙膜上的蛋白质非特异结合位点,其作用类似预杂交液,防止后续步骤中与抗体结合反应时,抗地高辛抗体会非特异结合到膜上,造成膜的背景。缓冲液2的封闭主要成分是里面的BSA。缓冲液2是用缓冲液1配制的。在膜进行缓冲液2封闭前,先在缓冲液1中平衡,目的是让膜适应缓冲液2的作用环境。缓冲液3是检测缓冲液,是用于配制底物液的。它给碱性磷酸酶分解其底物NBT/BCIP提供最佳作用环境。
     
    2013/3/29 16:59:44
    提问者:周学生

    实验七杂交探针的问题

    实验七杂交探针的制备, “低熔点琼脂糖加50ml1*TAE”,TAE在这里的作用是什么?加TE的作用是什么? 

    王松梅老师 2013/3/29 17:05:28
    1*TAE是电泳缓冲液,在此处的作用是为了制备琼脂糖凝胶。(请参考试验二)第五步加TE也只是提供一个缓冲系统,让低熔点琼脂糖溶解其中。
     
    2013/3/29 16:58:58
    提问者:李学生

    实验五细胞基因组DNA的制备及其浓度问题

    实验五细胞基因组DNA的制备及其浓度的测定(P18)> 用TBS重悬细胞,这一步要达> 到什么样的目的?TBS在这里的作用机制是怎样的? 

    王松梅老师 2013/3/29 17:04:55
    TBS是一种缓冲液,在此处的作用主要是为了洗涤细胞,把残留的细胞培养液洗干净。没有什么特殊的目的。所以可能有些试验室习惯用类似PBS,TE等的缓冲液,都没有本质区别。
     
    2013/3/29 16:58:07
    提问者:郭学生

    实验二重组DNA的提取相关问题

    实验二重组DNA的提取及酶切鉴定P6
    75%的酒精是不是用于去除无机盐成分的? 乙酰化BSA是起什么作用的? 为什么要乙酰化? 

    王松梅老师 2013/3/29 17:04:24
    75%的酒精是用于去除无机盐成分的,因为有些盐成分可能会对后续的操作如酶切等产生影响。BSA能促进多数内切酶的活性,所以现在酶切一般都比较喜欢加。当然,如果不用,不会对酶切有影响。但是,如果BSA质量不好,可能会影响酶切效果,所以一般建议用乙酰化BSA。
     
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